Fece carriera nella gerarchia ecclesiastica cominciando come segretario del cardinale Ghisleri, poi papa Pio V, fino a diventare Segretario di Stato; nel 1570 fu nominato cardinale e vescovo di Senigallia; nel 1588 divenne Vicario generale di Roma.

Rusticucci prese sotto la sua protezione l'ordine cistercense e la chiesa di S.Susanna, che fece riedificare interamente.